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Sep 12, 2023

Quantificazione della fissazione biologica dell'azoto mediante Mo

Scientific Reports volume 12,

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 22011 (2022) Citare questo articolo

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La fissazione biologica dell'azoto (BNF) da parte del molibdeno canonico e delle isoforme complementari del vanadio e della sola nitrofasi del ferro è la fonte naturale primaria di azoto appena fissato. Comprendere i controlli sul ciclo globale dell’azoto richiede la conoscenza dell’isoforma responsabile del BNF ambientale. Il test di riduzione isotopica dell'acetilene (ISARA), che misura il frazionamento dell'isotopo stabile del carbonio (13C/12C) tra etilene e acetilene nei test di riduzione dell'acetilene, è uno dei pochi metodi in grado di quantificare i flussi BNF isoforma-specifici. L'applicazione dell'ISARA classica è stata impegnativa perché l'attività ambientale del BNF è spesso troppo bassa per generare etilene sufficiente per le analisi isotopiche. Qui descriviamo un metodo ad alta sensibilità per misurare l'etilene δ13C mediante accoppiamento in linea della preconcentrazione di etilene alla spettrometria di massa del rapporto gascromatografia-combustione-isotopo (EPCon-GC-C-IRMS). I requisiti di etilene nei campioni con il 10% v/v di acetilene sono ridotti da > 500 a ~ 20 ppmv (~ 2 ppmv previa rimozione dell'acetilene offline). Per aumentare la robustezza riducendo l'errore di calibrazione, i mutanti di Azotobacter vinelandii dell'isoforma singola della nitroasi e i test sui campioni ambientali si basano su una fonte comune di acetilene per la produzione di etilene. L'applicazione del metodo ISARA a bassa attività BNF (LISARA) a terreni a bassa attività di fissazione dell'azoto, lettiera di foglie, legno decomposto, crittogame e termiti indica BNF complementare nella maggior parte dei tipi di campioni, richiedendo ulteriori studi sul BNF isoforma-specifico.

L’azoto (N) stabilisce fondamentalmente i limiti della produttività biologica, probabilmente limitando le risposte degli ecosistemi naturali al cambiamento ambientale globale1,2,3. La fissazione biologica dell’azoto (BNF), il processo procariotico che converte il diazoto atmosferico (N2) in ammoniaca, è il principale input biologico di nuovo N biodisponibile per i bilanci globali e regionali di N. Svolge quindi una funzione biogeochimica chiave in diversi ecosistemi, tra cui foreste tropicali, temperate e ad alta latitudine, erba montana e arbusti, nonché ambienti bentonici e oceanici aperti4,5. La nitrogenasi, il metalloenzima responsabile del BNF, esiste in tre isoforme primarie, caratterizzate dal metallo di transizione presente nel sito attivo: la nitrogenasi canonica e quella "alternativa", o più recentemente definita "complementare" di solo vanadio (V) e ferro ( Nitrofasi solo Fe)6,7. Le nitrogenasi solo V e Fe sono Mo-indipendenti e contengono i più abbondanti metalli in traccia V e Fe di origine crostale al posto di Mo8.

Determinare il contributo delle diverse isoforme della azotosi al BNF ambientale è fondamentale per comprendere i controlli meccanicistici sul BNF dell’ecosistema, in particolare il modo in cui i cicli biogeochimici accoppiati di macronutrienti e metalli in traccia biologicamente attivi rispondono alle perturbazioni antropogeniche. Poiché i calcoli del tasso di BNF basati sui metodi tradizionali (ovvero, test di riduzione dell'acetilene e metodi di abbondanza naturale di 15N/14N) sono sensibili all'isoforma della nitroenzimatica9,10,11, l'errata attribuzione delle isoforme della nitrozoasi attive nel BNF può alterare le stime del budget di N di quanto fino al 50%12,13, influenzando lo stato e la gestione dell'ecosistema N.

La specificità del metallo dei flussi BNF ambientali può ora essere valutata con l'applicazione del monitoraggio del flusso specifico per isoforma tramite il test di riduzione isotopica dell'acetilene (ISARA) e metodi di resa in etano combinati con analisi della sequenza genica della nitrofasi6,12,13,14. Questi approcci hanno identificato contributi significativi di nitratosi complementari solo V e Fe al BNF non rizobico in diversi campioni che vanno dalla lettiera di foglie di mangrovie temperate dell'Everglade, ai sedimenti di paludi salmastre costiere temperate e ai cianolicheni boreali12,13,15,16. Più recentemente, uno studio sul BNF cianolico attraverso un gradiente nutritivo di una foresta boreale di 600 km ha fornito la prima prova su scala di ecosistema del ruolo della V-nitrogenasi nel sostenere gli input di BNF in condizioni limitate di Mo13, convalidando un'ipotesi di lunga data sul "backup" ruolo delle nitroasi complementari originariamente suggerito da studi di laboratorio17. Inoltre, bassi rapporti tra l'attività di riduzione dell'acetilene e dell'azoto (cioè rapporti R), suggestivi di BNF complementare, sono stati osservati per il suolo temperato9, il muschio boreale11,18 e il legno in decomposizione19. Inoltre, geni complementari e non caratterizzati della nitratosi sono stati rilevati nel pacciame di legno20, nell'intestino delle termiti21, nel suolo9, nel muschio22 e nei cianolicheni23,24. Questi studi, insieme all'accumulo di esempi di BNF limitato al Mo nei biomi delle foreste boreali18,25,26, temperate e tropicali27,28,29,30,31,32,33 suggeriscono che il BNF complementare e indipendente dal Mo potrebbe svolgere un ruolo globale. Tuttavia, la quantificazione dei tassi di BNF Mo-indipendenti nei campioni ambientali, che spesso hanno una bassa attività BNF, è stata impegnativa poiché il metodo più affidabile per l'attribuzione complementare del BNF, ISARA12, richiede rese di etilene molto più elevate di quelle tipicamente osservate (ad es., suolo, muschio , la lettiera fogliare genera tipicamente < 300 ppmv di etilene nel corso di incubazioni del test di riduzione dell'acetilene di 1-2 giorni). Uno studio più ampio del BNF complementare e dei suoi controlli all'interno di importanti ecosistemi richiede miglioramenti metodologici di ISARA.