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Dec 01, 2023

Un kit di strumenti optogenetici per la luce

Nature Communications volume

Nature Communications volume 14, numero articolo: 1034 (2023) Citare questo articolo

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Gli antibiotici sono un meccanismo di controllo chiave per la biologia sintetica e la microbiologia. I geni di resistenza vengono utilizzati per selezionare le cellule desiderate e regolare le popolazioni batteriche, tuttavia il loro utilizzo fino ad oggi è stato in gran parte statico. Il controllo spaziotemporale preciso della resistenza agli antibiotici potrebbe consentire un’ampia varietà di applicazioni che richiedono il controllo dinamico della suscettibilità e della sopravvivenza. Qui utilizziamo la ricombinasi Cre fotoinducibile per attivare l'espressione dei geni di resistenza ai farmaci in Escherichia coli. Abbiamo dimostrato la resistenza attivata dalla luce a quattro antibiotici: carbenicillina, kanamicina, cloramfenicolo e tetraciclina. Le cellule esposte alla luce blu sopravvivono in presenza di concentrazioni letali di antibiotici, mentre quelle tenute al buio no. Per ottimizzare l'induzione della resistenza, variamo il promotore, il sito di legame del ribosoma e la forza della variante enzimatica utilizzando costrutti basati su cromosomi e plasmidi. Quindi colleghiamo la resistenza inducibile all'espressione di un enzima di acido grasso eterologo per aumentare la produzione di acido ottanoico. Questi strumenti di resistenza optogenetica aprono la strada al controllo spaziotemporale della sopravvivenza cellulare.

I geni di resistenza agli antibiotici sono ampiamente utilizzati nella biologia sintetica. Sono inclusi nei costrutti genetici per garantire la propagazione del plasmide. Anche i geni di resistenza svolgono un ruolo importante nei metodi di clonazione. Gli esempi includono le inserzioni cromosomiche, dove l'espressione dei geni di resistenza può essere utilizzata come marcatore selettivo per un'integrazione riuscita1, o la creazione di librerie di trasposoni, dove la resistenza ai farmaci viene utilizzata come meccanismo di selezione intermedio prima di essere scambiata con una sequenza alternativa2,3.

Sebbene i geni di resistenza agli antibiotici siano un elemento fondamentale della ricerca sulla biologia sintetica e sulla biotecnologia microbica, esistono pochi metodi per il controllo dinamico della loro espressione. La capacità di controllare la resistenza ai farmaci nello spazio e nel tempo potrebbe aprire nuove strade per la ricerca sulla biologia di sintesi. Per analogia, quando Sheth et al.4 hanno sviluppato un'origine inducibile della replicazione, un'altra caratteristica onnipresente nei costrutti della biologia sintetica, ha dato il via a nuove aree di ricerca, tra cui l'archiviazione di dati biologici5 e la diagnostica dei riboswitch a cellule intere6. Il controllo spaziotemporale sulla resistenza ai farmaci potrebbe consentire la modellazione spaziale nei biomateriali viventi7, la selezione di singole cellule da sistemi microfluidici8,9 e una migliore comprensione del ruolo svolto dalle dinamiche nella resistenza clinica agli antibiotici10. Ad esempio, la resistenza si diffonde spesso attraverso eventi di trasferimento genico orizzontale11,12, che sono difficili da monitorare e controllare a livello di singola cellula. Nuovi sistemi di controllo offrono il potenziale per studi futuri che quantificano come diverse disposizioni spaziotemporali delle cellule che acquisiscono resistenza possono portare alla proliferazione o al collasso a livello di popolazione.

I metodi optogenetici sono uno strumento potente e ampiamente utilizzato per controllare l'espressione genica13. La fornitura di luce alle cellule può essere regolata nello spazio e nel tempo e può essere integrata direttamente nei flussi di lavoro computazionali14,15. I sistemi optogenetici nei batteri sono stati utilizzati per controllare l'espressione genica per una varietà di applicazioni13,16, tra cui guidare il flusso metabolico17, regolare il microbioma intestinale18, controllare la morfologia cellulare19 e regolare le dinamiche di co-coltura20. L’uso della luce per controllare la sopravvivenza cellulare è stato al centro dell’ingegneria microbica in tutte le specie. Ad esempio, la regolazione optogenetica è stata utilizzata per controllare la resistenza alla nourseotricina in Saccharomyces cerevisiae21 e la resistenza alla bleomicina in Yarrowia lipolytica22. Nell'Escherichia coli, la luce è stata utilizzata per controllare la resistenza agli antibiotici tramite antibiotici foto-ingabbiati progettati individualmente23 o sfruttando la fotosensibilità naturale della tetraciclina24. Tuttavia, poiché questi metodi richiedono un’attenta ingegneria proteica o sfruttano proprietà specifiche di un singolo farmaco, non si generalizzano facilmente ai diversi meccanismi di resistenza. Un approccio alternativo utilizzava un promotore fotoinducibile per controllare in modo reversibile la resistenza al cloramfenicolo20,25. Tale metodo potrebbe essere generalizzato ad altri geni di resistenza, tuttavia gli esperimenti erano limitati al controllo dell'enzima cloramfenicolo acetiltransferasi. La piattaforma ideale per la resistenza inducibile dalla luce sarebbe generalizzabile per diversi geni di resistenza agli antibiotici e sintonizzabile su diverse concentrazioni di antibiotici per consentire in modo flessibile diversi studi di biologia sintetica e microbiologia.